大鼠原代角膜成纖維細胞操作步驟

大鼠原代角膜成纖維細胞操作步驟

傳代步驟：

棄去培養上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1 - 2次。

加2ml消化液（0.25% Trypsin - 0.53mM EDTA）于培養瓶中，置于37℃培養箱中消化1 - 2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養瓶后加少量培養基終止消化。

按6 - 8ml/瓶補加培養基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1 - 2mL培養液后吹勻。

將細胞懸液按1:2到1:5的比例分到新的含8ml培養基的新皿中或者瓶中。

復蘇步驟：

將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1 - 2mL培養基后吹勻。換液并檢查細胞密度。

凍存步驟：

以T25瓶為例：

細胞凍存時，棄去培養基后，PBS清洗瓶底1 - 2次后加入1ml，細胞變圓脫落后，加入2ml培養基終止消化，可使用血球計數板計數。

1000RPM離心5分鐘去掉上清，用血清重懸浮，加DMSO至最終濃度為10%。加入DMSO后迅速混勻，按每1ml的數量分配到凍存管中，注意凍存管做好標識。

將凍存管置于程序降溫盒中，放入 - 80℃冰箱，至少2個小時以后轉入液氮灌儲存，記錄凍存管位置以便下次拿取。