概述：
熒光定量PCR的基本原理就是在PCR擴增過程中，隨著PCR循環(huán)數(shù)的遞增，PCR產(chǎn)物不斷積累，熒光信號也會相應的增加，這樣就可以通過熒光強度的變化來對PCR反應進行實時的監(jiān)測。產(chǎn)品僅供科研使用本公司根據(jù)您的科研需求可以提供SYBR Green染料法和TaqMan探針法。通過對DNA或RNA的熒光定量PCR監(jiān)測, 實現(xiàn)基因的相對定量、定量和定性分析。

實時熒光定量PCR：
實時熒光定量PCR技術有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點檢測的局限，實現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號的強度，并記錄在電腦軟件之中，通過對每個樣品Ct值的計算，根據(jù)標準曲線獲得定量結(jié)果。因此，實時熒光定量PCR無需內(nèi)標是建立在兩個基礎之上的：
1）Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達Ct值所在的循環(huán)數(shù)時，剛剛進入真正的指數(shù)擴增期（對數(shù)期），此時微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性極好，即同一模板不同時間擴增或同一時間不同管內(nèi)擴增，得到的Ct值是恒定的。
2）Ct值與起始模板的線性關系由于Ct值與起始模板的對數(shù)存在線性關系，可利用標準曲線對未知樣品進行定量測定，因此，實時熒光定量PCR是一種采用外標準曲線定量的方法。
外標準曲線的定量方法相比內(nèi)標法是一種準確的、值得信賴的科學方法。利用外標準曲線的實時熒光定量PCR是迄今為止定量最準確，重現(xiàn)性*的定量方法，已得到全世界的公認，廣泛用于基因表達研究、轉(zhuǎn)基因研究，藥物考核、病原體檢測等諸多領域。
探針熒光定量PCR試劑盒原理分析如下圖：

使用方法：
一、多殺巴斯德菌探針法熒光定量PCR試劑盒稀釋PCR陽性對照（以10E2-10E7拷貝/μL這6個10倍稀釋度為例）
1. 注意：由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴散病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照，只提供可以直接使用的DNA片段作為陽性對照。
2. 標記6個離心管，分別為7，6，5，4，3，2。
3. 用帶芯槍頭分別加入45 μL熒光PCR專用模板稀釋液（用帶芯槍頭，下同）。
4. 在7號管中加入5 μL 1×10E8拷貝/μL 的陽性對照，充分震蕩1分鐘，得1×10E7拷貝/μL的陽性對照。放冰上待用。
5. 換槍頭，在6號管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E6拷貝/μL的陽性對照。放冰上待用。
6. 換槍頭，在5號管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL的陽性對照到5號管中，充分震蕩1分鐘，得1×10E5拷貝/μL的陽性對照。放冰上待用。
7. 重復上面的操作直到得到6個稀釋度的陽性對照。放冰上待用。
二、樣品DNA的制備
8. 如果有N個樣品，必須設置N+2個提取，多出的一個是PC（樣品制備陽性對照），一個是NC（樣品制備陰性對照）。可以用10μL上步制備的PCR陽性對照的第4號（濃度為1×10E4 拷貝/μL，10μL相當于1萬拷貝）或第5號（濃度為1×10E5 拷貝/μL，10μL相當于10萬拷貝）再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為PC。另外用水作為NC。如果每次制備需要200μL樣品，則PC和NC的體積也必須是200μL。
9. 用自選方法純化樣品的DNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù)病毒DNA提取試劑盒兼容。
三、設置qPCR反應（20 μL體系，在樣品制備室進行）
10. 如果只做1次重復，則標記N+9個PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于PCR陰性對照，6個用于PCR陽性對照。如果做2-3次重復，則反應設置數(shù)量相應增加2或3倍。
11. 產(chǎn)品僅用于科研在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設置完畢后才設置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后加）

熒光定量PCR服務：
產(chǎn)品僅供科研使用簡介：實時熒光定量PCR技術于1996年由美國Applied Biosystems公司推出，該技術不僅實現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，它具有特異性更強、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點，目前該技術已被廣泛用于檢測細胞mRNA表達量的變化；比較不同組織的mRNA表達差異；驗證基因芯片，siRNA干擾的實驗結(jié)果等。我公司為您提供全套實時熒光定量PCR技術服務，全部實驗皆使用進口試劑完成，主要定量PCR儀器。
1、熒光定量PCR服務要求：
（01）請您提供新鮮的且盡量多的材料；或直接提供純化好的總RNA（大于 5 ug/樣品）；或直接提供純化好的DNA（大于 5 ug/樣品）。
（02）請?zhí)峁┮阎娜L基因序列。
（03）請?zhí)峁┍M可能詳細的背景資料：DNA/RNA 來源等
2、熒光定量PCR操作程序
（01）引物（探針）設計與合成。
（02）提取DNA/RNA，樣本逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。
（03）進行Real Time PCR實驗，進行實驗結(jié)果分析。
（04）實驗完成后，提供完整的實驗報告（含軟件分析結(jié)果）及引物等實驗材料。
3、熒光定量PCR的收費標準：
  我公司根據(jù)客戶的樣品數(shù)量進行不同的收費標準。
C2 Others Human 人 C2 / Compleme Compone 2 人細胞裂解液 (陽性對照) dADP，3Na2′-脫氧腺苷-5′-二嶙酸三鈉鹽300u高，97%

人細胞;HOS三拂磺醋鈰 CqRIUM(III) TRIFLUOROMqTHcNqSULFONcTq 76089-77-2

人成纖維細胞(HMF)(5×105)2-(N-啉)乙磺酸shēng huà shì jì容量：保存：-20℃10/100ug/支

CM-H112人脂肪細胞完全培養(yǎng)基100mL1-Hexadecanol1-十六醇100克AR，99%

小鼠漿細胞瘤;MPC-11 小鼠直腸平滑肌細胞完全培養(yǎng)基 100mL(a-淀粉酶)
L6(大鼠成肌細胞) 5×106cells/瓶×2 小鼠 AXR2 / CMG2 人細胞裂解液 (陽性對照) 鈦shēng huà shì jì容量：25克

非酶細胞裂解液NECDSD-半胱酸鹽酸一水... D-Cysteine hydrochloride monohydrate,... 32443-99-5 250MG 通用試劑

CD63 Others Human 人 CD63 / Tspan-30 / Teaspanin-30 人細胞裂解液 (陽性對照) 厄貝沙坦相關物質(zhì)A Irbqscrtcn Rqlctqd CoMpound c;1-pqntcnoylcMino-cyclopqntcnqccrboxylic ccid [2'-(1H-tqtrczol-5-yl)-biphqnyl-4-ylMqthyl]-cMidq 74881-23-2

CHO-K1 中國倉鼠卵巢細胞亞株L-鼠李糖shēng huà shì jì容量：500克

CL-0030Bcap-37(人癌細胞)5×106cells/瓶×238937-66-5異羥1酸OCTANE-1,8-DIxy7noXAMIC ACID
MRC-5 人胚鹽酸表阿霉素(標準品)Epirubicin HCl質(zhì)量規(guī)格：HPLC≥98%,標準品

恒河猴肺細胞;RM-L1埃替非巴肽，依非巴特;安普利肽，依非巴肽Eptifibatide Acetate質(zhì)量規(guī)格：>98%,BR

SW 1990 [SW-1990, SW1990] , 人細胞鹽酸埃羅替尼Erlotinib hcl 質(zhì)量規(guī)格：>98.5%,BR,可用于細胞培養(yǎng)

人細胞;LNCaP 大鼠肺大動脈平滑肌細胞完全培養(yǎng)基 100mL鹽酸埃羅替尼（標準品）Erlotinib hcl 質(zhì)量規(guī)格：HPLC>98%,標準品

胰腺導管上皮細胞Many types of cells包裝：5 × 105方(1ml)爾它培南鈉;厄他培南鈉Ertapenem 質(zhì)量規(guī)格：含量>90%,單鈉鹽
多殺巴斯德菌探針法熒光定量PCR試劑盒中國倉鼠卵巢細胞(亞系克隆);CHO-HCV-p75-氮胞苷/阿扎胞苷/5-氮雜胞嘧啶核苷Azacitidine (5-Azacytidine)質(zhì)量規(guī)格：度> 98%,BR，可用于細胞培養(yǎng)

小鼠結(jié)締組織L細胞株929克隆;L-929 [L929] 小鼠視網(wǎng)膜色素上皮細胞完全培養(yǎng)基 100mL阿糖腺苷(標準品)Vidarabine/Ara-A質(zhì)量規(guī)格：>98%,標準品

293A，人胚腎上皮細胞系(腺病毒包裝級別) Human氨芐西林/氨芐青霉素Ampicillin Trihydrate質(zhì)量規(guī)格：>900 mcg/mg,BR,可用于細胞培養(yǎng)

CD24 Others Human 人 CD24 人細胞裂解液 (陽性對照) 氨芐西林/氨芐青霉素(標準品)Ampicillin Trihydrate質(zhì)量規(guī)格：含量測定

人肺動脈內(nèi)皮細胞裂解物HPAECL阿替美唑鹽酸鹽Atipamezole HCl質(zhì)量規(guī)格：>99%,BR
實驗過程：
一、試劑準備
1. DNA模板
2．對應目的基因的特異引物（在PCR反應中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設計的引物。可以是DNA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設計。因此，擴增不同的基因需要設計不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調(diào)整好反應程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴增。一般：在93℃預變性3-5min，進入循環(huán)擴增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結(jié)束反應，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。
4．PCR的電泳檢測：如在反應管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進行抽提反應混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。
三、注意事項
１．PCR反應應該在一個沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進行。zui好設立一個專用的PCR實驗室。
２．純化模板所選用的方法對污染的風險有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡單越好。
３．所有試劑都應該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應戴手套。
４．PCR試劑配制應使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾除菌或高壓滅菌。
５．試劑都應該以大體積配制，試驗一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量儲存，從而確保實驗與實驗之間的連續(xù)性。
６．試劑或樣品準備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應洗滌干凈并高壓滅菌。
７．PCR的樣品應在冰浴上化開，并且要充分混勻。